Elisa试剂盒实验常见疑问解答

Top1: 背景高

详细描述：空白孔数据（OD450 ）大于0.5，有的甚至高于1.0，一般问题是加入TMB 显色极快，整板变蓝色。

回复：

1，主要怀疑点：洗板不充分

1)机器洗版：确保机器设置的针头能吸干孔中液体，并且加液针头能加液大于350ul，加液针头没有被异物或者结晶盐堵住。

2)手动洗板，严格按照步骤，使用干净灭菌的枪头和加样槽，使用无氧化剂的吸水纸。加350ul洗液，静置90秒，在吸水纸上拍干孔中液体后再加入下一步洗液或者试剂。

3)特别注意，在加入TMB前的洗板步骤极其重要，残留的HRP酶会直接导致TMB显色。

2，次要怀疑点：

1)TMB 已经污染，检测TMB是否透明无色，如果偏蓝就是污染了。

2)检查配制洗液的水是否污染，要求使用的水是双蒸水，三蒸水或无离子水，水中的Fe3+,Cu3+,Co3+等过渡金属，以及HClO都会氧化TMB。

3)酶标板受潮，长霉，或者试剂过期。

4)环境污染，空气中有导致显色的物质或者粉尘。

Top2:显色较弱，没有说明书提供的数据阳性强

回复：

1)检查试剂是否按照说明书中要求的保存条件保存，特别是浓缩检测抗体和浓缩SABC， 如果放在-20度，融化后会严重影响其活性。

2)移液器是否较准，可以用去离子水较准移液器，1000ul=1.0g 100ul=0.1g  10ul=10mg

37度培养箱是否较准温度（建议用水银温度计放入水杯中，平衡12小时以上进行测量）。

3)SABC工作液和TMB在孵育前进行37度平衡半小时。

4)未严格按照说明书纸质版提供的方法操作。

5)试剂盒过期。

Top3：复孔做的不好，CV值差异大

回复：

1)复孔OD450数值在5-2.5之间计算的偏差相对较小，小于0.5会由于操作误差导致计算的CV值偏高，复孔样品数量在5-10个最佳。

2)操作时按照标准动作进行加样，比如要求枪头不能碰触到孔壁内侧和底面，枪头尖部的残留液体可以触碰到液面，使之流入样品孔。

3)加样尽量快速准确，不要产生气泡。

4)样品需要做预实验，使用不同浓度进行测试，找到最佳稀释比。错误的稀释比会导致复孔误差大。

Top4：显色太快，背景小于0.2，但是样品没有阳性。试剂盒工作正常，但是样品没有阳性。

回复：

1)样品是否保存妥当。蛋白容易降解，最好保存在-80，或者新鲜样品立即检测。

2)样品含有的基质影响抗原抗体结合，导致没有阳性。需要适当稀释样品 1/5，1/10，1/100，1/1000来摸索最佳检测稀释比，稀释液稀释样品后会消弱基质效应，阳性就会升高。

3)部分试剂盒要求4度过夜孵育样品和标准品，如果样品稀释后还是检测不到阳性，建议4度16小时孵育标准品和样品，其它步骤在按照说明书提供的温度和时间进行操作