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细胞增殖及活性检测

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  细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下,通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂系列过程。其中核DNA的复制倍增是整个过程的重要特征。细胞增殖检测技术广泛应用于分子生物学遗传学肿和瘤生物学免疫学药理和药代动力学等研究领域。

  检测细胞存活与增殖的方法主要包括观察DNA合成含量和检测细胞代谢活性两种,前者主要有Brdu、EDU检测等,后者主要有MTT、CCK8等检测,客户可根据处理药物数量等因素选择合适的检测方法。

  BrdU检测

  BrdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物,可掺入正在合成的DNA。当细胞处于DNA合成期(S期),BrdU就可以掺入新合成的DNA中。利用特异性结合BrdU的抗体即可检测正在处在S期的细胞,从而评估细胞增殖情况。

  实验步骤(贴壁细胞):

  1. 在孔板中接种合适密度的细胞,培养过夜

  2. 配制BrdU工作液

  3. 给细胞换新鲜培养液后,加入BrdU工作液

  4. 继续孵育适当时间(取决于细胞生长速度)

  5. 弃上清,加入4%多聚甲醛进行固定,室温孵育15min

  6. 弃上清,PBS洗3遍,每次5min

  7. 加入0.3% Triton X 100进行通透,室温孵育10-15min

  8. 弃上清,加3%的BSA溶液室温孵育1h

  9. 弃上清,PBS洗3遍,每次5min

  10. 加入一抗溶液,室温孵育适当时间或4℃过夜孵育

  11. 弃上清,PBS洗3遍,每次5min

  12. 加入二抗溶液,室温避光孵育适当时间

  13. 弃上清,PBS洗3遍,每次5min

  14. 核染色:加入核染料,室温避光孵育适当时间

  15. 弃上清,PBS洗3遍,每次5min

  16. 在显微镜下进行观察和采集数据

  实验结果展示:

  HeLa细胞用本试剂盒检测细胞增殖的效果图。无BrdU组观察不到红色荧光

  (最左侧一列);BrdU (10μM)孵育2小时组有明亮的红色荧光(中间一列);而用10mM的DNA合成抑制剂羟基脲(Hydroxyurea)提前预处理0.5 h后,红色荧光显著减弱,说明DNA合成抑制后,BrdU的掺入被显著抑制(最右侧一列)。

 

  EdU检测

  EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中,基于EdU与染料的共轭反应可以进行高效快速的细胞增殖检测分析,可以有效地检测处于S期的细胞百分数。

  实验步骤(贴壁细胞):

  1. 在孔板中接种合适密度的细胞,培养过夜

  2. 配制EdU工作液

  3. 给细胞换新鲜培养液后,加入EdU工作液

  4. 继续孵育适当时间(取决于细胞生长速度)

  5. 弃上清,加入4%多聚甲醛进行固定,室温孵育15min

  6. 弃上清,PBS洗3遍,每次5min

  7. 加入0.3% Triton X 100进行通透,室温孵育10-15min

  8. 弃上清,PBS洗3遍,每次5min

  9. 配制EdU反应液

  10. 加入EdU反应液,室温避光孵育适当时间

  11. 弃上清,PBS洗3遍,每次5min

  12. 核染色:加入核染料,室温避光孵育适当时间

  13. 弃上清,PBS洗3遍,每次5min

  14. 在显微镜下进行观察和采集数据

  实验结果展示:

  如下图,HeLa细胞用本试剂盒检测细胞增殖的效果图。无EdU组观察不到

  红色荧光(最左侧一列);EdU (10μM)孵育2 h组有明亮的红色荧光(中间一列);而用10mM的DNA合成抑制剂羟基脲(Hydroxyurea)提前预处理0.5小时后,红色荧光显著减弱,说明DNA合成抑制后,EdU的掺入被显著抑制(最右侧一列)。

 

  MTT检测

  MTT是噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide),可被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物甲臜(formazan)。甲臜可被DMSO完全溶解,并通过酶标仪测定570 nm波长附近的吸光度。细胞增殖速度越快,则吸光度越高;细胞毒性越大,则细胞增殖减慢从而导致吸光度降低。

  实验步骤(贴壁细胞):

  1. 准备96孔板,设置好实验组,对照组,空白组(不加细胞,只加等量培养基)。除空白组,每孔加入100 μL细胞悬液(细胞密度依据具体细胞生长速度和实验需求决定),放入培养箱,培养24 h

  2. 每孔加入50 μL MTT工作液,放入培养箱孵育4 h,使MTT还原为甲臜

  3. 小心吸出上清液,每孔加150 μL的DMSO使甲臜溶解,用平板摇床摇匀

  4. 酶标仪测定570 nm处吸光度

  5. 结果分析:

  (1) 将各测试孔OD值减去本底OD值(空白组),各组OD值用(x(—)±s)表示

  (2) 细胞存活率% =(加药细胞 OD/对照细胞 OD)×100%。

 

  CCK-8检测

  CCK-8(Cell Counting Kit 8)试剂中的主要成分WST-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜,生成甲臜的量与细胞数成正比,可间接测定活细胞数量。该法重复性好,灵敏度高,操作简便,毒性小。

  实验步骤(贴壁细胞):

  1. 准备96孔板,设置好实验组,对照组,空白组(不加细胞,只加等量培养基)。除空白组,每孔加入100 μL细胞悬液(细胞密度依据具体细胞生长速度和实验需求决定),放入培养箱,培养24 h

  2. 每孔加入10 μL CCK-8溶液,放入培养箱孵育1~4 h

  3. 酶标仪测定450 nm处吸光度

  4. 结果分析:

  (1) 将各测试孔OD值减去本底OD值(空白组),各组OD值用(x(—)±s)表示

  (2) 细胞存活率% =(加药细胞 OD/对照细胞 OD)×100%。

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