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【技术分享】怎样制备高质量的抗体

时间:2021-06-25 09:55:52 来源:未知 点击:

传统的抗体制备都是从抗原刺激免疫动物产生强烈免疫应答开始,其中单克隆抗体是从免疫动物脾脏取B细胞与无限增殖的瘤细胞体外融合,对融合成功的杂交瘤细胞进行亚克隆,从而根据应用目的筛选对应的细胞株,然后通过细胞培养或收集腹水进一步纯化得到抗体;而多克隆抗体是采集动物抗血清,直接亲和纯化得到抗体。不管是哪种抗体的制备,都离不开高效的动物免疫。图1为单、多克隆抗体的制备流程示意图。
 


 
图1 单、多克隆抗体的制备流程示意图
 
动物免疫利用的是生物体自身的体液免疫应答机制,通过抗原的持续刺激先后启动初级免疫反应和次级免疫反应,实际操作中以血清中抗体效价来衡量实际免疫效果。抗原刺激机体后启动初级反应一般会有一个滞后期,此时幼B细胞经过克隆筛选、增殖,然后分化成记忆细胞或浆细胞。经过滞后期,血清效价呈指数增长达到一个峰值然后下降。初级免疫反应中,会首先分泌IgM,然后经过抗体亚型转换,IgG比例会升高。
次级免疫反应的启动依赖于记忆B细胞和记忆T细胞的数目,记忆细胞再次遇到相同抗原就能被激活,从而导致次级免疫反应的发生。当记忆细胞数目远大于幼B细胞时,次级反应启动更快、强度更大。次级反应相比初级反应滞后期更短,浆细胞和血清效价的峰值更高,持续时间更长。同时,此时分泌的抗体经过亲和力成熟和亚型转换,质量更高。图2为一般免疫进程中血清效价变化曲线示意图。

图2 免疫进程中血清效价变化曲线示意图
 
动物免疫一般选择健康的年青成年雄性动物,免疫系统发育成熟且不受性周期的影响而发生波动。为确保动物在整个免疫进程中的健康无疫病状态,除了对动物来源有要求外,饲养环境也需进行控制。严格来说,动物需饲养于SPF级屏障系统内, 实施严格的微生物和寄生虫控制。图3为菲恩生物免疫基地小鼠饲养SPF级车间和兔饲养洁净区。

图3 菲恩生物免疫基地
 
通常抗原需要先用佐剂乳化后再行注射,抗体制备中最常用的弗氏佐剂主要成分为矿物油和羊毛脂,其中首次免疫需使用添加卡介苗或灭活的结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂。佐剂的作用主要是延缓抗原的释放,增强吞噬细胞的吞噬和对抗原的呈递。抗原极为宝贵时可采用淋巴结内微量注射,此时可不使用佐剂,抗原只需10~100μg。
开始一项免疫,除了上面提到的通用性原则,还需要考虑动物种属的选择、免疫剂量的使用、注射方式以及间隔时间的控制。
1) 抗原与免疫动物的种属差异越远越好;亲缘关系太近,意味着抗原同源性高不被免疫系统识别;另外,要注意有些抗原在免疫某些种类动物时免疫原性极差,如胰岛素对家兔、多种酶类(如胃蛋白酶原等)对山羊等,免疫时皆不易出现抗体。
2) 免疫剂量应根据抗原性强弱、分子量大小和免疫时间做相应调整。抗原量多,时间间隔长,剂量可适当加大。大动物抗原剂量(以蛋白抗原为准)约0.5~1mg/只,小动物约0.1~0.6mg/只。有时主观希望加强免疫效果而不适当地加大剂量,往往会弄巧成拙。
3) 免疫注射的途径有多种,包括足掌、肘窝、颈背部等淋巴结密集区皮下和皮内注射,另外还有肌肉注射和静脉注射。最广泛使用的是皮下注射方式,某些情形下皮内注射有优势。图4为常见的免疫注射途径。