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技术指南

蛋白质紫外吸收与浓度测定

时间:2021-06-25 09:53:17 来源:未知 点击:

在蛋白和抗体纯化工作中,如何准确的进行定量一直是一个棘手的问题。传统的方如
Bradford,BCA等操作繁琐,耗时长,而通过测定蛋白质的紫外吸收来定量,则非常快速方便。
蛋白质拥有的紫外吸收性质是来自芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸分子内含有共轭双键,在280纳米波长附近具有最大的光吸收峰。由于大多数蛋白质均含有酪氨酸、色氨酸残基,所以测定蛋白质在280纳米波长处的吸光度,是分析溶液中蛋白质含量的一种最快速的方法法。
 
其优点是快速,对样品无破坏,缺点在于此法是根据酪氨酸(Tyr),苯丙氨酸(Phe),
色氨酸(Trp)残基的强吸收值来测定的,不同的蛋白质其含量不同,所以当蛋白中缺乏这几种氨基酸时,定量就不准了,就得考虑其他方法。另外核酸,和其他所有含有苯环共轭π键的物质(如蛋白洗脱用的咪唑)都会影响其定量,在测定前应先透析除去。
    
 
下面我们来看看如何利用微量分光光度计来测定蛋白浓度。首先打开软件,选择Protein A280。
 
再在右上角选择样品的类型,1Abs=1mg/ml为测定未知蛋白的选项(如果是测试抗体浓度,可以选择igG 预设参数,大部分厂家的设备都含有这个参数)。
 
然后用纯水将比色皿清洗三次,选择合适的溶液作为背景,滴入2µl,按blank
减去背景。再用纯水将比色皿清洗三次,滴入2µl样品,按measure测定。下方就会显示样品的A280值即为浓度。
到这一步还没完,我们需要到https://web.expasy.org/protparam/,上输入蛋白的序列来查找消光系数,用测得的A280除以该蛋白的消光系数,才是最终的准确浓度。
 
菲恩生物严格把控每一个生产的蛋白或抗体产品的质量,质控方面使用传统的SDS-Page胶染色,对比标准品浓度的BSA蛋白,确定浓度和纯度,同时参考全进口微量分光光度计以获得最准确的数据,让产品在纯度和浓度上不会出现偏差。
 
举例菲恩生产蛋白验证的过程的结果图(DOG43为蛋白编号):
1:12% SDS-PAGE验证(其中 BSA标准品为1mg,上样10ul)
2:DOG43蛋白序列进行分析,计算消光系数。
3,微量分光光度计浓度测定结果: