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【技术分享】Western Blot实验步骤详解

时间:2021-06-25 09:50:03 来源:未知 点击:

什么是Western Blot
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所(Friedrich Miescher Institute)的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔•伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
 
Western Blot的基本原理
与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似,但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
Western Blot的分类
根据WB显色的方法分为以下几种:放射自显影;底物化学发光ECL;底物荧光ECF;底物DAB显色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,发表文章通常是用底物化学发光ECL。
WB操作步骤包括蛋白提取,含量测定,SDS-PAGE电泳,免疫反应,化学发光,凝胶图像分析。
 
Western Blot 实验操作指南
 
01    蛋白样本的制备 
 
(Ⅰ)样本的处理 
❶ 组织样本处理:取待测组织样本,用预冷的PBS洗去组织表面血液及内 部杂物。称重剪碎,加入适量RIPA裂解液混合物( 1mL的RIPA裂 解液中加入10μL PMSF)进行匀浆裂解。匀浆后冰上震荡裂解60min。在35%-40%的功率下,超声处理样本1min(冰浴条件下进行),超声2s,间隔2s,确保细胞充分裂解,降低样本粘度。4℃,12,000rpm离心5min,取上清待测定蛋白浓度。
 
❷ 细胞样本处理:收集待测细胞样本,用预冷的PBS洗去培养基等成分。加入适量RIPA 裂解液混合物(1 mL 的 RIPA 裂解液中加入 10μL PMSF)进行冰上 裂解 60min。在 35%-40%的功率下,超声处理样本 1min(冰浴条件下进行),超声2s,间隔 2s,确保细胞充分裂解,降低样本粘度。4℃,12,000rpm 离心 5min,取上清待测定蛋白浓度。
 
(Ⅱ)测定浓度
BCA 法测定蛋白浓度(Cat# K001) 
 
(Ⅲ)收样及保存
用 PBS 调整蛋白浓度,按照蛋白样本:5×SDS 上样缓冲液=4:1 的比例加入 5×SDS 上样缓冲液,沸水煮 10min。12,000rpm 离心 2min,收取上清即可进行后续的 Western Blot 实验,或保存于 -20℃或-80℃。
 
注:待测样本建议总蛋白上样量为 50-100μg,尽量保持各待测样本上样体积接近 10μL。 
 
 
02    电泳 
❶ 根据靶蛋白的分子量的大小,配制不同浓度的分离胶。每个泳道加入待测样本,并预留一个泳道加入 5μL 的预染蛋白 Marker,以验证目的分子量大小及转膜程度。加入 1×电泳缓冲液,开始电泳。
 
❷ 90v 恒压电泳,待溴酚蓝指示剂移动至浓缩胶与分离胶交界处成线状,改为恒压 120v跑完全程,直至电泳结束。
 
 
03    转膜(湿转)
❶ 根据靶蛋白的分子量选择不同孔径的PVDF或NC 膜。膜先在甲醇中浸泡 5min 使其活化,然后将膜浸泡于1×转膜缓冲液(含 20%甲醇)中。同时将滤纸和纤维垫也浸泡在转膜缓冲液中待用。
 
❷ 按照黑色板(负极)-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF或NC膜-滤纸-纤维垫-白色板(正极)依次放好,排出气泡,夹紧后放入湿转电转槽内。根据靶蛋白分子量调整转膜条件。请务必保证转膜过程在低温条件下进行。 
注:此为湿转的参考步骤,如用其他转膜方法,请依具体情况进行调整。  
 
❸ 转膜完成后,小心取出NC膜,TBST洗涤1min。
 
 
04    免疫印迹
❶ 用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液(封闭液)浸泡PVDF或NC膜,室温摇床封闭 1.5h。
 
❷  用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液按照说明书推荐的稀释比稀释相应的抗体,使 NC 膜浸泡于一抗孵育液中,4℃摇床孵育过夜。
 
❸ TBST 充分洗涤 NC 膜 3 次,15min/次。 
 
❹ 用含 5%脱脂奶粉的 TBST 溶液按照说明书推荐的稀释比稀释相应的二抗,室温摇床孵育 1h。
 
❺ TBST 充分洗涤 NC 膜 3 次,15min/次。 
 
 
05    显色曝光
❶ 将ECL 化学发光检测试剂盒(Cat# K026)中的 A 液与 B 液按 1:1 比例混匀。
 
❷ NC 膜从 TBST 洗液中取出后用滤纸吸干水分,均匀滴加ECL 混合液于 NC 膜上,排出气泡,即可曝光。 
 
❸ 调节对比度,多次曝光获取最佳图片效果。 
 
 
Western Blot 实验注意事项
 
01    样本制备
蛋白提取的过程中注意添加蛋白酶抑制剂,低温操作,避免蛋白的降解。粗存过程中尽量分装冻存,避免样本的反复冻融。
 
02    抗体选择
首先确定抗体的宿主和反应性,一抗来源必须和二抗搭配且不能和样本来源相同。比如二抗是羊抗小鼠,一抗就要选择小鼠来源的,不少人常常先有二抗,再买一抗就很受限了,毕竟一抗要比二抗贵多了。所以建议先选好一抗再来确定二抗。还要确定好抗体的应用,必须选择能做WB的抗体。
 
03    标记物的选择
根据底物选择合适的标记物,一般选择HRP标记二抗。