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常见问题与解答

Elisa试剂盒实验常见疑问解答

时间:2021-06-25 10:07:55 来源:bqbio 点击:

Top1: 背景高

详细描述:空白孔数据(OD450 )大于0.5,有的甚至高于1.0,一般问题是加入TMB 显色极快,整板变蓝色。

回复:

1,主要怀疑点:洗板不充分

1)机器洗版:确保机器设置的针头能吸干孔中液体,并且加液针头能加液大于350ul,加液针头没有被异物或者结晶盐堵住。

2)手动洗板,严格按照步骤,使用干净灭菌的枪头和加样槽,使用无氧化剂的吸水纸。加350ul洗液,静置90秒,在吸水纸上拍干孔中液体后再加入下一步洗液或者试剂。

3)特别注意,在加入TMB前的洗板步骤极其重要,残留的HRP酶会直接导致TMB显色。

 

2,次要怀疑点:

1)TMB 已经污染,检测TMB是否透明无色,如果偏蓝就是污染了。

2)检查配制洗液的水是否污染,要求使用的水是双蒸水,三蒸水或无离子水,水中的Fe3+,Cu3+,Co3+等过渡金属,以及HClO都会氧化TMB。

3)酶标板受潮,长霉,或者试剂过期。

4)环境污染,空气中有导致显色的物质或者粉尘。

 

Top2:显色较弱,没有说明书提供的数据阳性强

回复:

1)检查试剂是否按照说明书中要求的保存条件保存,特别是浓缩检测抗体和浓缩SABC, 如果放在-20度,融化后会严重影响其活性。

2)移液器是否较准,可以用去离子水较准移液器,1000ul=1.0g 100ul=0.1g  10ul=10mg

37度培养箱是否较准温度(建议用水银温度计放入水杯中,平衡12小时以上进行测量)。

3)SABC工作液和TMB在孵育前进行37度平衡半小时。

4)未严格按照说明书纸质版提供的方法操作。

5)试剂盒过期。

 

Top3:复孔做的不好,CV值差异大

回复:

1)复孔OD450数值在5-2.5之间计算的偏差相对较小,小于0.5会由于操作误差导致计算的CV值偏高,复孔样品数量在5-10个最佳。

2)操作时按照标准动作进行加样,比如要求枪头不能碰触到孔壁内侧和底面,枪头尖部的残留液体可以触碰到液面,使之流入样品孔。

3)加样尽量快速准确,不要产生气泡。

4)样品需要做预实验,使用不同浓度进行测试,找到最佳稀释比。错误的稀释比会导致复孔误差大。

 

Top4:显色太快,背景小于0.2,但是样品没有阳性。试剂盒工作正常,但是样品没有阳性。

回复:

1)样品是否保存妥当。蛋白容易降解,最好保存在-80,或者新鲜样品立即检测。

2)样品含有的基质影响抗原抗体结合,导致没有阳性。需要适当稀释样品 1/5,1/10,1/100,1/1000来摸索最佳检测稀释比,稀释液稀释样品后会消弱基质效应,阳性就会升高。

3)部分试剂盒要求4度过夜孵育样品和标准品,如果样品稀释后还是检测不到阳性,建议4度16小时孵育标准品和样品,其它步骤在按照说明书提供的温度和时间进行操作