昆虫杆状病毒表达系统

昆虫杆状病毒表达原理
　　该系统主要包括以下两个组分:(1) 用于插入目的基因的pFastBac载体,在该系列载体中,目的基因的高水平表达由Autographa californica多核多角体病毒(multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)的多角体启动子(polyhedrin(PH)promoter)驱动.载体多克隆位点的两侧均为Tn7元件,同时还含有一个庆大霉素抗性基因(gentamicin resistance gene)和形成mini Tn7所需的SV40 polyA signal.(2)含杆状病毒穿梭载体bacmid (bMON14272, 136kb)和辅助质粒(helper plasmid,用于表达转座必须的转座蛋白) pMON7124的大肠杆菌DH10Bac宿主菌株.Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统利用遗传转座(genetic transposition)得到重组病毒.DH10Bac宿主包含的bacmid bMON14272含小型F复制子,卡那霉素抗性基因,mini-attTn7位点和lacZα互补因子(可通过蓝白斑筛选);辅助质粒pMON7124包含四环素抗性和tnsABCD区域,该区域表达转座反应所需的转座蛋白.当pFastBac重组质粒转化进入DH10Bac细胞后,pFastBac载体上的mini-Tn7位点和DH10Bac宿主菌中bacmid上的mini-attTn7位点之间发生转座(transposition),产生重组bacmid.该转座会导致bacmid上的LacZ基因的破坏,因此可以通过在细菌培养平板上进行蓝白斑筛选来鉴别含有重组bacmid的DH10Bac菌落,从白色菌落的DH10Bac克隆中可分离出含有编码目的基因的重组bacmid DNA,后者进一步感染昆虫细胞后可产生含有重组子的杆状病毒即可启动外源重组蛋白的表达.表达目的蛋白的杆状病毒在被扩增和滴度测定后,高滴度的杆状病毒即可用于感染昆虫细胞以进行大规模的目的蛋白的表达.

　　图1. 重组杆状病毒质粒构建原理图

　　昆虫杆状病毒表达流程
　　1.把目的基因克隆至pFastBac系列载体产生重组质粒;2.转化pFastBac重组质粒到DH10Bac大肠杆菌中,转化后利用蓝白斑筛选重组菌株.
　　挑取白斑,培养过夜;
　　3.提取重组bacmid DNA.重组bacmid的PCR鉴定.利用 PCR反应对阳性克隆进行进一步的验证;4.重组bacmid转染昆虫细胞;
　　5.收集P1代杆状病毒;
　　6.P1代杆状病毒的扩增.P1代病毒再次感染昆虫细胞可获得P2代病毒;7.P2代杆状病毒的扩增.如果P2代病毒滴度仍然偏低,可对P2代病毒再次进行扩增,扩增方法同P2代病毒的扩增方法.P2代病毒感染昆虫细胞后最终会获得滴度更高的P3代病毒;8.病毒感染昆虫细胞进行目的蛋白的大规模表达.建议在不同的时间阶段,如感染后24、48、72或96小时收集细胞,裂解细胞,SDS-PAGE并进行Western Blot检测以确定最佳的停止蛋白表达的时间;目的蛋白的纯化及检测.