毕赤酵母表达系统

毕赤酵母系统表达原理
　　毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源，甲醇代谢首先是醇氧化酶利用氧气将甲醇氧化为甲醛，由于醇氧化酶与氧气的结合率较低，导致毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子（AOX1和AOX2）。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓表型可分离 Mut+（methanol utilization plus） 和Muts（methanol utilization slow） 菌株。
　　毕赤酵母能够高效的表达外源基因，是因为其具有强启动子乙醇氧化酶启动子（AOX1和AOX2）。通过把构建的质粒/载体线性化（主要采用酶切），通过同源重组的方式整合到启动子AOX的下游，一般是插入到5’AOX启动子和转录终止子信号之间的单克隆位点，从而实现外源基因在毕赤酵母中的高效表达。

　　毕赤酵母同源重组的方式
　　质粒/载体和酵母表达基因图谱

　　图1. 载体图谱：5’AOX1启动子位点，转录终止子TT，3’AOX1位点

图2. 酵母宿主菌基因

　　质粒载体上的PAOX位点（PAOX启动子）或PAOX转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点与酵母宿主菌基因发生同源重组
　　在酵母宿主菌基因组的下游或者上游插入一个或多个质粒载体基因。如插入的质粒载体不破坏酵母宿主菌基因本身的AOX1，因此重组转化子的表现型不变为Mut+，反之为Muts。

　　图3. 重组质粒插入3’AOX1

　　质粒/载体基因替换酵母宿主菌的AOX1位点
　　酵母宿主菌的AOX1启动子位点被质粒/载体基因完全替代，原有的酵母AOX1启动子被破坏，表现型为Muts,取代其的是质粒/载体基因组上的PAOX，目的基因，HIS4表达序列。取代事件发生的不如基因插入事件发生的多。

　　图4. AOX1位点被替换

　　多拷贝插入
　　简单来说就是质粒/载体基因的多次插入（插入到酵母宿主菌基因组上），自发概率很低

　　图5. 多拷贝插入

　　毕赤酵母系统表达流程
　　1.重组酵母表达质粒构建；
　　2.重组质粒线性化；
　　3.毕赤酵母感受态细胞制备及转化；
　　4.鉴定筛选高表达菌株，通过PCR方法确定阳性转化株， SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况，并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达；
　　5.蛋白表达条件的优化，挑选阳性克隆进行常规表达筛选，并对其中表达较好的菌株优化表达条件。对挑选出来的单克隆菌株，优化培养及诱导条件（培养基，菌体密度，甲醇浓度，诱导时间等），提高目标蛋白的表达量；
　　6.大量蛋白表达、纯化及检测。