在酵母双杂交系统中，编码诱饵蛋白和靶蛋白的基因分别克隆进BD和AD 载体，这样使得待研蛋白可融合表达GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活结构域。以上的两种载体共转化酵母细胞。如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。最终通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相互作用。